Hplc 5a472x

PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DALAM KAPLET DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) DENGAN DETEKTOR PHOTO DIODE-ARRAY (PDA)

I. TUJUAN 1.1 Mengetahui prinsip pemisahan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan detektor Photo Diode-Array (PDA). 1.2 Mengetahui

prosedur

kerja

metode

High

Performance

Liquid

Chromatography (HPLC) dengan detektor Photo Diode-Array (PDA). 1.3 Menetapkan kadar parasetamol dalam kaplet dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) detektor Photo DiodeArray (PDA).

II. DASAR TEORI 2.1 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industriindustri makanan. Beberapa perkembangan

HPLC terbaru antara lain:

miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral (Gandjar dan Rohman, 2007). Prinsip kerja HPLC yaitu dengan bantuan pompa, fase gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam. Solutsolut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam

1

akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram (Putra, 2004).

Gambar 1. Skema Instrumen HPLC 1. Pompa (Pump) Fase gerak dalam HPLC adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Effendy, 2004). Beberapa persyaratan dari sistem pompa HPLC adalah :  Memberikan tekanan sampai 6000 psi (lbs/in2)  Memberikan kecepatan aliran 0,1-10 mL/menit  Aliran terkontrol dengan reprodusibilitas 0,5% atau kurang (lebih baik)  Antikarat oleh sebab itu seal pompa terbuat dari bahan baja atau teflon 2

(Mulja dan Suharman, 1995).

2. Injektor (injector) Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum : a. Stopped Flow b. Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfer, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil klan resolusi tidak dipengaruhi b. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfer. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μL dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. (Effendy, 2004). Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katub teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal (Gandjar dan Rohman, 2007).

3

3. Kolom (Column) Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok : a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC). (Effendy, 2004). Kolom pada HPLC dibuat lurus (tidak dibuat melingakar sebagaimana kolom pada kromatografi gas ataupun bentuk U). Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi kolom; untuk mendapatkan harga H minimal. Efisien kolom dirumuskan sebagai : H = B/µ + Cs . µ + Cn . µ Keterangan : H

= JSPT

B/µ

= difusi longitudinal

Cs . µ = kecepatan transfermasa dalam fase diam Cn . µ = kecepatan transfermasa dalam fase gerak µ

= kecepatan linier fase gerak

Kolom kromatografi cair kinerja tinggi terbuat dari :  Bahan metal anti korosif dan tahan zat kimia  Bahan gelas tahan zat kimia

4

 Bahan gelas yang dilapisi bahan metal Kolom dibuat dengan diameter sangat kecil (dalam ukuran mikro) dimaksudkan agar kepekaan lebih teliti, menghemat pelarut pengembang, memperluas kemampuan detektor, dan jumlah sampel yang dianalisis lebih sedikit. Sedangkan fungsi dari kolom yang dibuat pendek adalah untuk menghasilkan resolusi yang baiuk, memperkecil harga diameter rata-rata pertikel fase diam, waktu tR, tM singkat (mengurangi pengaruh bagian instrumentasi kromatografi cair kinerja tinggi terhadap hasil pemisahan). (Mulja dan Suharman, 1995)

4. Detektor (Detector) Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: a. Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa b. Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks c. Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia (Effendy, 2004). Macam-macam detektor : 1. Detektor “Photo Diode-Array” Merupakan detektor UV-Vis dengan beberapa keistimewaan :  Sistem optik tidak memakai cermin dan menjamin “Spektral Puriti” dan mengabaikan “Stay Radiation”

5

 Hanya ada satu lensa satu fokus  Detektor yang tidak ada pergerakan mekanis sehingga menjamin ketepatan panjang gelombang penuntun  kecepatan deteksinya 300-400 kali detektor PMT  Rentang pengukuran 190-600 nm  Hollografik grating yang tidak bergerak

2. Detektor RI Detektor UV-Vis “Photo Diode-Array” merupakan detektor menjamin derau dan pelayanan instrumental yang relatif sangat kecil (terabaikan) (Mulja dan Suharman, 1995). Detektor PDA mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run) (Gandjar dan rohman 2007). Sampai saat ini para ilmuan telah mengenal tiga macam detektor RI untuk dipakai pada analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap macam-macam karbohidrat. Ketiga macam detektor RI itu adalah RI detektor interferensi radiasi; RI detektor yang memakai prisip hukum bias dan refleksi dari Fresnel; RI detektor dengan prinsip pembelokan jalan radiasi. Ketiga macam detektor RI tersebut sama-sama memakai sumber radiasi denagn intesitas dan panjang gelombang tertentu (Mulja dan Suharman, 1995). Detektor yang digunakan dalam penetapan kadar ini adalah Diode-array Detector (DAD). Keunggulan dari detektor diode array adalah selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan.dengan demikian, DAD memberikan lebih banyak informasi komposisi sampel disbanding dengan detektor UV lainnya. Detektor ini juga akan menghasilkan spectrum tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk system HPLC yang digunakan sehingga dengan detektor ini dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra senyawa yang sudah diketahui serta memberikan resolusi kurang lebih 1 nm (Gandjar dan Rohman, 2007, Watson, 2007).

6

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Idealnya detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :  Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusible.  Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.  Stabil dalam pengoperasiannya.  Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.  Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas.  Tidak peka terhadap peubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. (Gandjar dan Rohman, 2007). Dikenal dua sistem elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi yaitu : a. Sistem elusi isokratik Pada sistem ini elusi dilakukan dengan satu macam larutan pengembang atau lebih dari satu macam larutan pengembang (pelarut pengembang campur) dengan perbandingan yang tetap, misalnya metanol-air dengan perbandingan 50 : 50 v/v (Mulja dan Suharman, 1995). b. Sistem elusi gradien Pada sistem ini elusi dilakukan dengan pelarut pengembang campur yang perbandingannya berubah dalam waktu tertentu, misalnya metanol-air dengan perbandingan 40 : 60 v/v ; dengan kenaikan kadar metanol 8% setiap menit (Mulja dan Suharman, 1995). Efek dari elusi gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom (Effendy, 2004). Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : 7

a. Total waktu analisis dapat direduksi b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa (Effendy, 2004).

2.2 Pengolahan Data (Data Handling) Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. Waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung dengan melihat kromatogram. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif (Effendy, 2004). 2.3 Fase gerak Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fase gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan detektor 4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) (Effendy, 2004).

8

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1 s/d 4 merupakan yang sangat penting (Effendy, 2004). Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk HPLC yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2) (Effendy, 2004).

2.4 Parameter Analisis dengan HPLC 2.4.1

Waktu retensi Waktu retensi merupakan lamanya waktu yang dibutuhkan solut untuk

melewati kolom. Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut-solut dicirikan dengan waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k’) yang berbading lurus dengan nilai D. Waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k’) dihubungkan oleh persamaan berikut:

tM (kadang-kadang ditulis dengan t0 yang dikenal sebagai waktu mati) merupakan waktu yang dibutuhkan oleh solut yang tidak tertahan untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karenanya perbandingan distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0, jadi tR = tM. Solut-solut yang memiliki nilai D dan k’ lebih besar dari 0 akan tertahan secara proporsional dan akan mempunyai waktu retensi yang lebih besar daripada tM. Kondisi kromatografi umumnya diatur sedemikian rupa sehingga nilai k’ lebih kecil daripada 20 untuk menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nilai k’ dapat dihitung dengan persamaan:

9

Dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut dikarakterisasi dengan volume retensi (VR) yang merupakan volume fase gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu retensi berbanding langsung dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan, sehingga diperoleh persamaan:

(Gandjar dan Rohman, 2007) 2.4.2

Migrasi dan retensi solut Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentuan oleh perbandingan

distribusinya (D), dan besar D ditentukan oleh afinitas relative solut pada kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam konteks kromatografi, nilai D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm).

Jadi, semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat, dan semakin kecil nilai D maka migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka campuran – campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan. (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.4.3

Efisiensi dan Resolusi Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah

efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Jumalah lempeng (N) dihitung dengan:

Nilai N juga dapat dihitung dengan :

10

⁄

TR

= waktu retensi solut

σ t = simpangan baku lebar puncak W ⁄ = lebar setengah tinggi puncak Wb

= lebar dasar puncak

Persamaan berikut digunakan untuk menggambarkan hubungan antara panjang kolom (L) dengan efisisensi kolom (H):

Dalam kromatografi gas (KG) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Rumus untuk menghitung resolusi adalah sebagai berikut:

Sebagaimana ditunjukkan oleh persamaan diatas, resolusi komponenkomponen dalam kromatografi tergantung pada waktu retensi relative pada sistem kromatografi tertentu dan tergantung pada lebar puncak. Untuk mengoptimisasi parameter-parameter ini supaya diperoleh resolusi yang maksimal, maka diperlukan suatu pemahaman terhadap sifat faktor-faktor yang mempengaruhinya. Meskipun waktu retensi komponen cukup menggambarkan banyaknya waktu yang diperlukan oleh solut tertentu terelusi dari sistem kromatografi, akan tetapi suatu parameter yang lebih berguna untuk menggambarkan retensi kromatografi adalah faktor retensi. (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.4.4

Faktor asimetri (faktor pengekoran) Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik

adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran (tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetris. Juka puncak 11

yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetrisitas merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi. Puncak asimetri muncul karena berbagai faktor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi. Cara menghitung nilai faktor pengekoran (tailing factor, TF):

Gambar 2. Pengukuran Tailing Factor

2.4.5

Faktor pemisahan atau selektivitas Faktor pemisahan atau selektivitas merupakan suatu ukuran yang potensial

dalam sistem kromatografi untuk pemisahan 2 senyawa. Faktor pemisahan atau selektifitas (α) dihitung dengan rumus :

Jika nilai α = 1, maka tidak ada pemisahan karena waktu retensi identik. Pemilihan fase diam dan fase gerak dapat mempengaruhi nilai α. (Gandjar dan Rohman, 2007).

12

2.5 Parameter Validasi Metode Validasi metode analisis menurut Unites States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007). 2.5.1

Kecermatan (accuracy) Kecermatan atau akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya (Harmita, 2004). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunak-an pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur (Harmita, 2004). Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spikedplacebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Harmita, 2004). Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia CRM atau SRM) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya) (Harmita, 2004). Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. % Perolehan kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Harmita, 2004).

13

Kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Vanderwielen, dkk menyatakan bahwa selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga ratarata selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang. Kriteria tersebut dinyatakan secara matematik sebagai berikut:

Xi =

hasil analisis

X0 =

hasil yang sebenarnya

I =

nilai t pada tabel t’ student pada atas 95%

S =

simpangan baku relatif dari semua pengujian

n =

jumlah sampel yang dianalisis

Kadar analit dalam metode penambahan baku dapat dihitung sebagai berikut:

C =

kadar analit dalam sampel

S =

kadar analit yang ditambahkan pada sampel

R1 =

respon yang diberikan sampel

R2 =

respon yang diberikan campuran sampel dengan tambahan

analit

14

Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut:

CF =

konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran

CA =

konsentrasi sampel sebenarnya

C*A =

konsentrasi analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).

Pada percobaan penetapan kecermatan, sedikitnya lima sampel yang mengandung analit dan plasebo yang harus disiapkan dengan kadar antara 50% sampai 150% dari kandungan yang diharapkan. Persen perolehan kembali seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD (Relative Deviation Standard). Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel di bawah ini: Analit pada matrik sampel (%)

Rata-rata yg diperoleh (%)

100

98-102

> 10

98-102

>1

97-103

> 0,1

95-105

0,01

90-107

0,001

90-107

0,000.1 (1 ppm)

80-110

0,000.01 (100 ppb)

80-110

0,000.001 (10 ppb)

60-115

0,000.000.1 (1 ppb)

40-120

Perolehan kembali analit dapat juga antara 99-101% pada tiap level.

15

2.5.2

Keseksamaan (precision) Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeability) atau ketertiruan (reproducibility) (Harmita, 2004). Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2% (Harmita, 2004). Karena metode presisi adalah fungsi penetapan kadar pada rentang yang dapat diterima menurut Debesis et. al. pada analisa menggunakan metode HPLC akan digunakan ketentuan presisi berikut: Tabel Rentang maksimum yang diperbolehkan (Perhitungan dibuat berdasarkan atas kepercayaan 99%). Rentang yang

Penetapan tunggal

Penetapan duplo

dapat diterima Metode RSD Sistem RSD Metode RSD Sistem RSD (% klaim)

(%)

(%)

(%)

(%)

98,5 - 101,5

0,58

0,41

0,82

0,58

97 – 103

1,2

0,82

1,6

1,2

95 – 105

1,9

1,4

2,7

1,9

90 – 110

3,9

2,8

5,5

3,9

90 – 115

4,8

3,4

6,9

4,8

90 – 125

6,8

4,8

9,6

6,8

85 – 115

5,8

4,1

8,2

5,8

16

9,7

6,9

50 – 150

19,4

13,7

2.5.3

75 – 125

Selektivitas (Spesifisitas) Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang

hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita, 2004). Penentuan selektivitas metode dapat diperoleh dengan dua jalan. Yang pertama (dan yang paling diharapkan adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dengan senyawasenyawa lain atau resolusi senyawa yang dituju ≥ 2. Cara kedua untuk memperoleh selektivitas adalah dengan menggunakan detektor selektif, terutama untuk senyawa yang terelusi bersama-sama (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.4 Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 – 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau –1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy). Dengan menggunakan kalkulator atau perangkat lunak komputer, semua perhitungan matematik tersebut dapat diukur (Harmita, 2004).

17

Protokol dalam parameter linearitas adalah metode harus menunjukkan linearitas dalam kisaran yang diharapkan. Linearitras harus diukur dan dilaporkan sebagai suatu konstanta faktor respon pada kisaran pengukuran-pengukuran yang diharapkan.

2.5.5 Rentang / Range / Kisaran Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan linearitas, akurasi, dan presisi yang dapat diterima (Harmita, 2004). Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama (mayor), maka konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan. Suatu strategi yang baik adalah mengkur baku dengan kisaran 25, 50, 75, 100, 125, dan 150% dari konsentrasi analit yang diharapkan (Gandjar dan Rohman, 2007).

18

2.5.6 Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ) Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas (Harmita, 2004).

2.5.7 Ketangguhan metode/ Kekasaran (ruggedness) Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lain-lain. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode (Harmita, 2004).

2.5.8 Kekuatan/ Ketahanan (Robustness) Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode, seperti persentase pelarut organic, pH, kekuatan ionic, suhu, dan sebagainya. Suatu praktek yang baik untuk mengevaluasi ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasi parameterparameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.9 Kesesuaian Sistem Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analisis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus dapat memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-

19

persyaratan

kesesuaian

sistem

biasanya

dilakukan

setelah

dilakukan

pengembangan metode dan validasi metode (Gandjar dan Rohman, 2007). USP menentukan parameter-parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis, yaitu meliputi bilangan lempeng teori (N), faktor tailing, kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan luas puncak serangkaian injeksi. Pada umumnya paling tidak ada dua criteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode. Nilai RSD tinggi puncak atau luas puncak dari 5 kali injeksi larutan baku pada dasarnya dapat diterima sebagai salah satu criteria baku untuk pengujian komponen yang jumlahnya banyak (komponen mayor) jika nilai RSD ≥ 1% untuk 5 kali injeksi. Sementara untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit, nilai RSD diterima jika antara 5-15% (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.6

Parasetamol Parasetamol atau Asetaminofen atau N-asetil-4-aminofenol mempunyai

rumus molekul C8H9NO2, BM 151,2 g/mol memiliki struktur molekul :

Gambar 3. Struktur Kimia Parasetamol (Moffat, et al, 2005) Kaplet parasetamol mengandung parasetamol, C8H9NO2, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Depkes RI, 1995). -

Organoleptis

: Serbuk hablur, putih, tidak berbau; rasa sedikit

pahit. -

Kelarutan

: Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1 N; mudah larut dalam etanol (Depkes RI, 1995). 20

-

pKa

: 9,5 (25o).

-

Titik leleh

:169o-170,5o.

-

pH

:5,3-6,5

-

Berat Molekul

: 419,45 gram/mol (Moffat, et al, 2005).

Parasetamol, N-(4-hidroksifenil) acetamide memiliki efek analgesik (pereda nyeri) dan antipiretik (pereda demam). Hal ini umumnya digunakan untuk menghilangkan sakit kepala, sakit kecil lainnya dan nyeri, dan merupakan bahan utama dalam banyak obat flu. Dalam kombinasi dengan analgesik opioid, parasetamol juga dapat digunakan dalam pengelolaan nyeri yang lebih parah seperti pasca bedah rasa sakit dan menyediakan perawatan paliatif pada pasien kanker lanjut. Mekanisme utama aksi adalah parasetamol dianggap sebagai penghambat siklooksigenase (Mula, 2011).

2.7 Kaplet Parasetamol Kaplet parasetamol mengandung parasetamol tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Penetapan kadar dilakukan dengan cara Kromatografi Cair kinerja Tinggi (HPLC), fase geraknya merupakan campuran air : metanol P (3 : 1), saring dan diudarakan. Buat larutan baku dengan timbang seksama sejumlah parasetamol BPFI, larutkan dalam fase gerak sehingga kadar lebih kurang 0,01 mg/mL. Larutan uji dibuat dengan timbang dan serbukkan tidak kurang dari 20 kaplet. Timbang seksama sejumlah serbuk kaplet setara dengan lebih kurang 100 mg parasetamol, masukkan ke dalam labu tentukur 200 mL, tambahkan lebih kurang 100 mL fase gerak, kocok selama sepuluh menit, encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Pipet 5mL larutan ke dalam labu tentukur 250 mL, encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Saring larutan melalui penyaring dengan porositas 0,5 µm atau lebih halus, buang 10 mL filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji. HPLC yang digunakan dilengkapi dengan detektor 243 nm dan kolom 3,9 nm x 30 cm berisi bahan pengisi L 1. Laju aliran lebih kurang 1,5 mL/menit. Lakukan kromatografi terhadap larutan baku, respon puncak.efisiensi kolom tidak kurang dari seribu lempeng teoritis, faktor ikutan tidak lebih dari 2 dan simpangan baku relatif pada

21

penyuntikan ulang tidak lebih dari 2%. Suntikkan secara terpisah sejumlah volume yang sama (lebih kurang 10 µL) larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam jumlah dalam mg, C8H9NO2, dalam serbuk kaplet yang digunakan dengan rumus : 10.000 C (

ru ) rs

C adalah kadar parasetamol BPFI dalam mg per mL larutan baku; ru dan rs berturut-turut adalah respons puncak dari Larutan uji dan larutan baku. (Depkes RI, 1995).

III. ALAT DAN BAHAN 3.1 Alat 1.

Mortir dan stamper

2.

Pipet volume 1 mL; 10 mL

3.

Botol vial

4.

Ball filler

5.

Pipet tetes

6.

Beaker glass

7.

Batang pengaduk

8.

Erlenmeyer

9.

Labu ukur 10 mL

10. Labu ukur 5 mL 11. Membran filter 12. Timbangan analitik 13. Kertas saring 14. Seperangkat instrumen HPLC merek Shimadzu 15. Syringe 16. Membran glass

22

3.2 Bahan 1.

Kaplet merek Grafadon

2.

Metanol

3.

Air

4.

Baku Parasetamol

IV. PERHITUNGAN 4.1 Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 1 mg/mL Diketahui : Kadar stok peracetamol yang dibuat = 1 mg/mL V larutan yang dibuat = 10 mL BM parasetamol = 151,16 mg/mmol Ditanya

: massa parasetamol…?

Jawab

:

Massa paracetamol 

konsentrasi BM

Massa paracetamol 

konsentrasi x BM x V BM



1 mg/ml x 151,16 mg/mmol x 10 ml 151,16 mg/mmol

= 1 mg/mL x 10 mL = 10 mg

4.2 Perhitungan Pembuatan Larutan Standar Parasetamol 100 µg/mL Diketahui : Konsentrasi larutan stok (M1) = 1 mg/mL Konsentrasi larutan yang dibuat = 100 µg/mL Volume larutan yang dibuat (V2) = 5 mL Ditanya

: Volume larutan stok yang diambil (V1)....?

Jawab

: M1 x V1  M 2 x V2 1 mg/ml x V1  100 μg x 5 ml

23

1000 μg/ml x V1  100 μg x 5ml

V1 = 0,5 mL 4.3 Pembuatan Pembuaan Larutan Standar Seri Parasetamol dengan Konsentrasi : 3 µg/mL, 6 µg/mL, 9 µg/mL, 12 µg/mL, 15 µg/mL dan 18 µg/mL 4.3.1 Larutan standar seri konsentrasi 3 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 3 µg/mL × 5 mL V1 = 0,15 mL 4.3.2 Larutan standar seri 6 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 6 µg/mL × 5 mL V1 = 0,3 mL 4.3.4 Larutan standar seri 9 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 9 µg/mL × 5 mL V1 = 0,45 mL 4.3.5 Larutan standar seri 12 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 12 µg/mL × 5 mL V1 = 0,6 mL 4.3.6 Larutan standar seri 15 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 15 µg/mL × 5 mL V1 = 0,75 mL 4.3.7 Larutan standar seri 18 µg/mL 100 µg/mL × V1 = 18 µg/mL × 5 mL V1 = 0,9 mL 4.4 Perhitungan Pembuatan Larutan Sampel Parasetamol dengan konsentrasi 10 mg/mL a.

Sampel I Diketahui

: Kadar parasetamol dalam kaplet

= 500 mg

massa serbuk 3 kaplet

= 2,0327 g

24

massa parasetamol yang diinginkan = 100 mg Ditanya

: massa serbuk parasetamol yang setara dengan 100 mg serbuk parasetamol = ...?

Jawab

:

Kadar parasetamol dalam 3 kaplet = 3 × 500 mg = 1500 mg = 1,5 g Massa kaplet yang setara 100 mg parasetamol = 100 mg  2032,7mg = 135,5 mg 1500 mg

Ditimbang sebanyak 135,5 mg serbuk kaplet parasetamol, dilarutkan dengan fase gerak (metanol) sampai 10 mL.

b.

Sampel II Diketahui

: Kadar parasetamol dalam kaplet

= 500 mg

massa serbuk 3 kaplet

= 2,0873 g

massa parasetamol yang diinginkan = 100 mg Ditanya

: massa serbuk parasetamol yang setara dengan 100 mg serbuk parasetamol = ...?

Jawab

:

Kadar parasetamol dalam 3 kaplet = 3 × 500 mg = 1500 mg = 1,5 g Massa kaplet yang setara 100 mg parasetamol = 100 mg  2087,3 mg 1500 mg

= 139,1 mg

Ditimbang sebanyak 139,1 mg serbuk kaplet parasetamol, dilarutkan dengan fase gerak (metanol) sampai 10 mL.

25

c.

Sampel III Diketahui

: Kadar parasetamol dalam kaplet

= 500 mg

massa serbuk 3 kaplet

= 2,0794 g

massa parasetamol yang diinginkan = 100 mg Ditanya

: massa serbuk parasetamol yang setara dengan 100 mg serbuk parasetamol = ...?

Jawab

:

Kadar parasetamol dalam 3 kaplet = 3 × 500 mg = 1500 mg = 1,5 g Massa kaplet yang setara 100 mg parasetamol = 100 mg  2079,4 mg 1500 mg

= 138,6 mg

Ditimbang sebanyak 138,6 mg serbuk kaplet parasetamol, dilarutkan dengan fase gerak (metanol) sampai 10 mL. Sehingga konsentrasi larutan sampel yang dibuat menjadi:

100 mg = 10 mg/mL 10 mL

4.5 Perhitungan Pengenceran Larutan Sampel 10 mg/mL menjadi 100 µg/mL Diketahui : Konsentrasi larutan sampel (M1) = 10 mg/mL Konsentrasi larutan yang dibuat = 100 µg/mL Volume larutan yang dibuat (V2) = 10 mL Ditanya

: Volume larutan sampel yang diambil (V1)....?

Jawab

: M1 x V1  M 2 x V2 10 mg/mL x V1  100 µg/mLx 10 mL 10 mg/mL x V1  1000 µg 10 mg/mL x V1  1 mg

V1 = 0,1 mL

26

4.6 Perhitungan Pengenceran Larutan Sampel 100 µg/mL menjadi 9 µg/mL Diketahui : Konsentrasi larutan sampel (M1) = 100 µg/mL Konsentrasi larutan sampel yang dibuat = 9 µg/mL Volume larutan yang dibuat (V2) = 10 mL Ditanya

: Volume larutan sampel yang diambil (V1)....?

Jawab

: M1 x V1  M 2 x V2 100 µg/mx V1  9 µg/mL x 10 mL 10 0 µg/mL x V1  90 µg

V1 = 0,9 mL V. PROSEDUR KERJA 5.1 Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 1mg/mL Ditimbang 10 mg baku parasetamol

Dilarutkan dengan metanol dalam beaker glass

Dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL

Ditambahkan metanol hingga tanda batas

5.2 Pembuatan Larutan Standar Parasetamol 100 µg/mL Dipipet 0,5 mL larutan stok parasetamol dengan konsentrasi 1mg/mL

Dimasukkan kedalam labu ukur 5 mL

27

Ditambahkan metanol hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen Dilarutkan dengan metanol 5.3 Pembuatan Pembuaan Larutan Standar Seri Parasetamol dengan Konsentrasi : 3 µg/mL, 6 µg/mL, 9 µg/mL, 12 µg/mL, 15 µg/mL dan 18 µg/mL Dipipet 0,15 mL; 0,3 mL; 0,45 mL; 0,6 mL; 0,75 mL dan 0,9 mL larutan standar parasetamol dengan konsentrasi 100mg/mL

Dimasukkan masing-masing kedalam labu ukur 10 mL

Ditambahkan metanol hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen Dilarutkan dengan metanol Maing-masing larutan dimasukkan kedalam vial

5.4 Pembuatan Larutan Sampel Parasetamol dengan konsentrasi 10 mg/mL Dibuat tiga larutan sampel. Masing-masing sampel dibuat dari 3 kaplet parasetamol dengan merk Grafadon

Ditimbang satu per satu bobot 3 kaplet dari masing-masing sampel yang akan dibuat

Ketiga kaplet tersebut digerus hingga homogen

28

Ditimbang sebanyak 135,5 mg (Sampel I) ; 139,1 mg (Sampel II); 138,6 mg (Sampel III) serbuk kaplet Grafadon yang telah digerus

Masing-masing dimasukkan kedalam beaker glass dan dilarutkan dengan 5 mL metanol hingga larut

Dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen 5.5 Pengenceran Larutan Sampel Dilarutkan 10 mg/mL dengan menjadimetanol 100 µg/mL Dipipet masing-masing 0,1 mL larutan sampel parasetamol dengan konsentrasi 1mg/mL

Masing-masing dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL

Ditambahkan metanol hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen Dilarutkan dengan metanol 5.6 Pembuatan Sampel dengan konsentrasi 9 µg/mL dari 100 µg/mL Dipipet masing-masing 0,9 mL larutan sampel parasetamol dengan konsentrasi 100 µg/mL

Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL

29

Ditambahkan metanol hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen Dilarutkan dengan metanol Masing-masing larutan dimasukkan kedalam vial 5.7 Pengkondisian Kolom Kromatografi Fase gerak metanol disaring dengan pompa vakum menggunakan membrane filter, lalu didegasing.

Dialirkan metanol ke alat melalui selang pelarut selama 30 menit dengan laju alir 1 mL/min 5.8 Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan Seri Larutan standar parasetamol dari konsentrasi terkecil ke konsentrasi terbesar yaitu 3 µg/mL, 6 µg/mL, 9 µg/mL, 12 µg/mL, 15 µg/mL dan 18 µg/mL diinjeksikan sebanyak 40 µL kedalam injektor HPLC

Discanning pada panjang gelombang 200-400 nm

Dicatat nilai AUC, waktu retensi dan similiarity factor-nya

Dibuat kurva kalibrasi standar parasetamol dan persamaan regresi linier y = bx + a, dimana y = AUC dan x = kadar sampel (µg/mL)

30

5.8 Penetapan Kadar Parasetamol Larutan sampel diinjeksikan kedalam injektor HPLC sebanyak 40 µL

Discanning pada panjang gelombang 200-400 nm

Data AUC yang diperoleh dimasukan ke dalam persamaan regresi linier

Langkah diatas dilakukan sebanyak 3 kali

Ditentukan perolehan kembali kadar parasetamol

VI. DATA PENGAMATAN 6.1. Data Penimbangan a. Penimbangan Bobot Kaplet Sampel Kaplet 1

2

3

Sampel

Bobot Total Serbuk

I

0,699 gram

0,6808 gram

0,6850 gram

2,0327 gram

II

0,7032 gram

0,7060 gram

0,6929 gram

2,0873 gram

III

0,6845 gram

0,7146 gram

0,6873 gram

2,0794 gram

31

b. Penimbangan Bobot Sampel dalam Kaplet Sampel

Bobot Sampel Kandungan

Bobot Serbuk yang

Parasetamol 100 mg

Tertimbang

I

135,5 mg

135,5 mg

II

139,1 mg

139,2 mg

III

138,6 mg

138,7 mg

6.2 Data AUC dan Waktu Retensi Larutan Standar Parasetamol Tabel 1. Data AUC dan waktu retensi Larutan Standar Parasetamol No

Kadar Larutan

Area Under

Waktu

Faktor

Standar

Curve

Retensi

Similaritas

Parasetamol

(AUC)

(menit)

1

3 µg/mL

537240

1,577

0,943

2

6 µg/mL

1227680

1,590

0,942

3

9 µg/mL

1286703

1,584

0,934

4

12 µg/mL

-

-

-

5

15 µg/mL

-

-

-

6

18 µg/mL

2168016

1,575

0,934

6.3 Kromatogram Larutan Standar 6.3.1

Kromatogram Larutan Standar Parasetamol 3 µg/mL

32

6.3.2

Kromatogram Larutan Standar Parasetamol 6 µg/mL

6.3.4

Kromatogram Larutan Standar Parasetamol 9 µg/mL

6.3.5 Kromatogram Larutan Standar Parasetamol 18 µg/mL

33

6.4 Data AUC dan Waktu Retensi Larutan Standar Parasetamol Tabel 6.4. Data AUC dan waktu retensi dari Sampel Parasetamol Sampel

Konsentrasi

Area Under

Waktu

Faktor

yang dibuat

Curve

retensi

Similaritas

(AUC)

(menit)

Serbuk 1

9 µg/mL

1183131

1,585

0,937

Serbuk 2

9 µg/mL

1213330

1,588

0,938

Serbuk 3

9 µg/mL

1667554

1,588

0,940

6.5 Kromatogram Larutan Standar 6.5.1

Kromatogram Larutan Sampel Parasetamol (Serbuk 1)

6.5.2

Kromatogram Larutan Sampel Parasetamol (Serbuk 2)

34

6.5.3

Kromatogram Larutan Sampel Parasetamol (Serbuk 3)

VII. PERHITUNGAN 7.1 Perhitungan Waktu Retensi Rata-rata sampel Parasetamol Tabel 2. Data waktu retensi sampel Parasetamol Sampel

tR (menit)

Serbuk 1

1,585

Serbuk 2

1,588

Serbuk 3

1,588

tR rata-rata =

tR1 tR 2  tR 3 3

=

1,585  1,588  1,588 3

=

4,761 3

= 1,587 menit

35

7.2 Penentuan Persamaan Regresi Linear dari Kurva Kalibrasi Karena hubungan linier hanya ditunjukkan oleh data ke-1, ke-3 dan ke-6, maka untuk menetapkan kadar, dibuat kurva kalibrasi dari ketiga data tersebut. Tabel 3. Data AUC Larutan Standar Parasetamol No

Kadar Larutan Standar

Area Under Curve

Parasetamol

(AUC)

1

3 µg/mL

537240

2

6 µg/mL

1227680

3

9 µg/mL

1286703

4

12 µg/mL

-

5

15 µg/mL

-

6

18 µg/mL

2168016

Kurva Kalibrasi Larutan Standar Paracetamol Area Under Curve (AUC)

2500000 2000000 1500000 1000000 Linear (Area Under Curve (AUC))

500000 0 0

5

10

15

20

Konsentrasi Larutan Standar Parasetamol (µg/mL)

Dari kurva kalibrasi parasetamol, diperoleh persamaan: y = bx + a y = 107866,18x + 251.991,1 Dimana : r2= 0,997 a = 251.991,1 b = 107866,18

36

7.3 Penentuan Kadar Sampel Parasetamol dalam µg/mL Tabel 4. Data AUC Sampel Parasetamol Sampel

Konsentrasi yang

Area Under Curve

Dibuat

(AUC)

Serbuk 1

9 µg/mL

1183131

Serbuk 2

9 µg/mL

1213330

Serbuk 3

9 µg/mL

1667554

Berdasarkan data tersebut, kadar parasetamol dalam sampel dapat ditentukan dengan memasukkan nilai AUC sampel ke dalam persamaan regresi linier a)

Sampel serbuk 1 Diketahui : y = AUC = 1183131 y = 107866,18x + 251.991,1 Ditanya

: x = ..... ?

Jawab

:

y = 107866,18x + 251.991,1

1183131= 107866,18x + 251.991,1 x = 8,63 µg/mL

b) Sampel serbuk 2 Diketahui : y = AUC = 1213330 y = 107866,18x + 251.991,1 Ditanya

: x = ..... ?

Jawab

:

y = 107866,18x + 251.991,1

1213330 = 107866,18x + 251.991,1 x = 8,91 µg/mL

c) Sampel serbuk 3 Diketahui : y = AUC = 1667554 y = 107866,18x + 251.991,1 Ditanya

: x = ..... ?

Jawab

:

y = 107866,18x + 251.991,1

37

1667554 = 107866,18x + 251.991,1 x = 13,12 µg/mL

7.4 Perhitungan konversi kadar sampel dalam mg a) Sampel serbuk 1 Diketahui :

Kadar sampel kaplet 1

= 8,63 µg/mL

Kadar sampel primer

= 10 mg/mL

Kadar sampel sekunder

= 100 µg/mL

Volume sampel primer

-

Ditanya

:

Jawab

:

= 10 mL

kadar sampel dalam mg ..... ?

Konversi dari kadar sampel (µg/mL) sebanding dengan sampel sekunder 8,63 µg/ml  100 µg/ml  95,88 µg/ml 9 µg/ml ................. (1)

-

Konversi dari kadar (1) sebanding dengan sampel primer 95,88 µg/ml 10 mg/ml  9,588 mg/ml 100 µg/ml ................... (2)

-

Konversi dari (2) sebanding 100 mg sampel 9,588 mg/mL  10 mL

= 95,88 m

Jadi, untuk sampel serbuk 1 kadar 8,63 µg/mL setara 95,88 mg Perolehan kembali = =

kadar yang diperoleh x100% kadar sebenarnya

95,88 mg 100% 100 mg

= 95,88 %

b) Sampel kaplet 2 Diketahui :

Kadar sampel 2

= 8,91 µg/mL

Kadar sampel primer

= 10 mg/mL

Kadar sampel sekunder

= 100 µg/mL

38

Volume sampel primer

-

Ditanya

:

Jawab

:

= 10 mL

kadar sampel dalam mg = ..... ?

Konversi dari kadar sampel (µg/mL) sebanding dengan sampel sekunder 8,91 µg/ml 100 µg/ml  99 µg/ml 9 µg/ml .................... (1)

-

Konversi dari kadar (1) sebanding dengan sampel primer 99 µg/ml  1 0mg/ml  9,9 mg/ml 100 µg/ml ...................... (2)

-

Konversi dari (2) sebanding 100 mg sampel 9,9 mg/mL  10 mL = 99 mg Jadi, untuk sampel kaplet B kadar 8,91 µg/mL setara 99 mg Perolehan kembali =

=

kadar yang diperoleh x100% kadar sebenarnya

99 mg  100% 100 mg

= 99 % c) Sampel kaplet 3 Diketahui :

-

Ditanya

:

Jawab

:

Kadar sampel 3

= 13,12 µg/mL

Kadar sampel primer

= 10 mg/mL

Kadar sampel sekunder

= 100 µg/mL

Volume sampel primer

= 10 mL

kadar sampel dalam mg = ..... ?

Konversi dari kadar sampel (µg/mL) sebanding dengan sampel sekunder 13,12 µg/ml 100 µg/ml  145,7 µg/ml 9 µg/ml .................... (1)

-

Konversi dari kadar (1) sebanding dengan sampel sekunder

39

 -

145,7 µg/ml  1 0mg/ml  14,57 mg/ml 100 µg/ml ...................... (2)

Konversi dari (2) sebanding 10 mg sampel 14,57 mg/mL  10 mL = 145,7 mg Jadi, untuk sampel kaplet B kadar 13,12 µg/mL setara 145,7 mg Perolehan kembali =

=

massa yang diperoleh x100% massa sebenarnya 145,7 mg  100% 100 mg

= 145,7 %

7.5 Perhitungan Standar Deviasi (SD) dan CV dari kadar sampel dalam mg Kadar rata- rata

=

X1 X 2  X 3 3

=

(95,88  99  145,7) mg 3

=

340,58 mg 3

=

113,5 mg

Kadar

Kadar rata-rata

sampel (x)

sampel ( x )

(x- x )

(x- x )2

95,88mg

113,5 mg

-17,62 mg

310,4644 mg2

99 mg

113,5 mg

-14,5 mg

210,25 mg2

145,7 mg

113,5 mg

32,2 mg

1036,84 mg2 1557,5544 mg2

∑

Standar Deviasi

=

 (x  x)

2

n -1

40

=

1557,5544 2

=

519,1848

= 22,78 mg Jadi kadar rata-rata sampel adalah 113,5 mg ± 22,78 mg.

STDV x100% x =

CV

22 ,78 x100% 113 , 5 =

= 20,07%

7.6 Perhitungan kadar sampel dalam tiap kaplet Diketahui :

= 100 mg

m rata- rata 3 kaplet yang diperoleh (ms)

= 113,5 mg

m paracetamol 3 kaplet sebenarnya

= 1500 mg

m paracetamol 1 kaplet sebenarnya

= 500 mg

m paracetamol 1 kaplet dari analisis = ….. ?

Ditanya : Jawab

m paracetamol 3 kaplet (ma)

:

Massa paracetamol 3 kaplet =

ms  1500 mg ma

=

113,5 1500 100

= 1.702,5 mg Massa paracetamol 1 kaplet yang diperoleh =

1702,5 mg 3

= 567,5 mg

41

7.7 Perhitungan Perolehan Kembali Diketahui : Kadar parasetamol dalam 1 kaplet (ka) = 500 mg Kadar rata- rata yang diperoleh (ks) = 567,5 mg Ditanya : Perolehan kembali = ...? Jawab

:

% perolehan kembali = =

Kadar sampel yang diperoleh  100 % Kadar sebenarnya 567,5 mg  100% 500 mg

= 113,5 % 7.8 -

Perhitungan LOD dan LOQ Menentukan AUC yang Telah Dimasukkan ke dalam Persamaan Regresi Linier Diketahui : Data yang digunakan dalam membuat persamaan regresi linier: Konsentrasi I

= 3 µg/mL

Konsentrasi III = 9 µg/mL Konsentrasi VI = 18 µg/mL Persamaan regresi linier : y = 107866,18x + 251.991,1 Ditanya : y” =.......? Jawab I.

:

y = 107866,18x + 251.991,1 y” = (107866,18 x 3) + 251.991,1 y” = 575.589,64

II.

y = 107866,18x + 251.991,1 y” = (107866,18 x 9) + 251.991,1 y” = 1.222.786,72

III.

y = 107866,18x + 251.991,1 y” = (107866,18 x 18) + 251.991,1 y” = 2.193.582,34

42

-

Menentukan Simpangan Baku Residual C (µg/mL)

y”

Y

y-y”

3

537.240

575.589,64

-38349,64

1470694888

9

1.286.703

1.222.786,72

63916,28

4085290849

18

2.168.016

2.193.582,34

-25566,34

653637741

Σ (y-y”)2

6209623478

Nilai Simpangan Baku Residual ( Jawab

Sy x

) = ...?

:

 y  y"

2

Sy x Sy x

Sy x

-

(y-y”)2

=

n2

6209623478 32

=

= 78.801,16

Menentukan nilai LOD dan LOQ Diketahui :

Sy x

= 78.801,16

Dari persamaan y = 107866,18x + 251.991,1; maka diketahui b = 107866,18 Ditanya : LOD dan LOQ = ...? Jawab

:

 LOD = =

3  Sy x Slope (b)

3 78.801,16 107866,18

= 2,19 µg/mL  LOQ =

10  Sy x Solpe (b)

43

=

10  78.801,16 107866,18

= 7,30 µg/mL

7.9 Perhitungan Parameter Kromatografi Plat teoritis rata-rata Nrata-rata =

N1  N2  N3 3

=

84,121  82,084  179,837 3

=

346,042 3

= 115,34

VIII. PEMBAHASAN Pada praktikum ini, dilakukan penetapan kadar paracetamol dalam suatu sedian obat berbentuk kaplet dengan menggunakan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan detektor Photo Diode-Array (PDA) yang bertujuan untuk mengetahui prinsip pemisahan, mengetahui prosedur kerja serta Menetapkan kadar parasetamol dalam kaplet dengan metode HPLC dengan detektor PDA. Metode HPLC ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi karena sederhana dan memiliki kepekaan yang tinggi (Munson, 1984). Prinsip dari metode ini pada umumnya sama dengan metode kromatografi, yaitu didasarkan pada perbedaan afinitas analit pada fase diam dan gerak (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada pemisahan ini metode kromatografi yang digunakan adalah metode kromatografi balik (reverse phase), dimana fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan fase diam bersifat non polar. Fase diam yang digunakan adalah C18 sedangkan. fase gerak yang digunakan adalah metanol pro HPLC. Oktadesil

44

silika (ODS atau C18) digunakan sebagai fase diam pada penetapan kadar parasetamol

karena

mampu

memisahkan

senyawa-senyawa

dengan

kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi. Mekanisme sorpsi dengan fase diam C18 adalah partisi dan fase terbalik. Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut (Gandjar dan Rohman, 2007) Metanol pro HPLC digunakan sebagai fase gerak karena metanol memiliki kemurnian yang tinggi dan sesuai dengan derajat HPLC, metanol mudah menguap sehingga mempercepat pencucian kolom, parasetamol memiliki sifat larut dalam pelarut alkohol (metanol) sehingga membantu proses analisis, dan jenis pemisahan yang dilakukan dalam praktikum ini adalah fase terbalik sehingga fase gerak disarankan bersifat polar (metanol merupakan pelarut semipolar). Sistem elusi yang dilakukan adalah elusi isokratik dimana komposisi fase gerak tetap sama selama proses elusi berlangsung. Penggunaan pelarut tunggal yaitu metanol sebagai fase gerak dengan sistem elusi isokratik ini bertujuan untuk mengefisienkan waktu selama praktikum Pada saat elusi, sistem dibantu dengan penggunaan pompa. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007). Sebelum digunakan, fase gerak harus dilakukan degassing untuk menghilangkan gas. Dengan adanya gas yang berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa atau detektor yang mana akan menyebabkan terbentuknya noise yang dapat mengganggu hasil kromatogram. Detektor yang digunakan pada metode HPLC ini adalah detektor photodiode array (PDA). Detektor ini merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat ditampilkan. Dengan detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat

45

dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem HPLC yang digunakan. Dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra senyawa yang sudah diketahui (Gandjar dan Rohman, 2007). Langkah awal yang dilakukan sebelum analisis adalah, kolom kromatografi harus dikondisikan terlebih dahulu seperti pengaturan tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom dengan menggunakan metanol. Sebelum dialirkan ke kolom, metanol disaring dengan membrane filter untuk menyaring pengotor-pengotor dari pelarut bahkan pengotor yang berukuran mikro. Setelah itu, laju alir dari pompa ditentukan sesuai keperluan yaitu 1 mL/menit. Untuk mendapatkan laju aliran pompa 10 mL/menit yaitu laju alir dinaikkan secara perlahan-lahan yang mana bertujuan agar tekanan dalam pompa stabil. Proses selanjutnya, dilakukan pencucian kolom menggunakan metanol selama 30 menit. Tujuan dari pencucian kolom

ini

adalah untuk

menghilangkan pengotor dan

mengkondisikan kolom sebelum dapat digunakan. Proses pengkondisian kolom dilakukan untuk meningkatkan kepekaan kolom dan menghindari pengotor atau sisa analit yang masih tertahan pada kolom pada analisis sebelumnya agar tidak mengganggu analisis dan merusak kolom. Selanjutnya dibuat larutan standar stok paraetamol dengan mengencerkan larutan stok 1 mg/mL menjadi 100 µg/mL. Kemudian dibuat larutan standar seri dan larutan sampel parasetamol. Larutan standar seri paracetamol dibuat dengan konsentrasi 3 µg/mL, 6 µg/mL, 9 µg/mL, 12 µg/mL, 15 µg/mL dan 18 µg/mL. Larutan standar seri dibuat dari hasil pemipetan larutan standar stok parasetamol 100 µg/mL. Larutan sampel dibuat dengan konsentrasi 9 µg/mL sebanyak 3 buah dengan menggunakan pelarut metanol. Digunakan pelarut metanol karena fase gerak yang digunakan adalah metanol. Sebelum diinjeksikan ke dalam kolom, semua larutan disaring terlebih dahulu dengan membrane filter berukuran 45 µm yang bertujuan untuk menyaring pengotor yang masih

46

tersisa bahkan yang berukuran mikro dari pelarut sehingga tidak menganggu kerja dari HPLC yang sifatnya sangat sensitif. Setelah dilakukannya penyaringan, salah satu larutan standar seri diinjeksikan kedalam kolom HPLC pada bagian injektor. Larutan seri diinjeksikan sebanyak 40 µL ke dalam kolom menggunakan syringe. Jumlah sampel yang ideal diinjeksikan ke dalam kolom adalah 20 µL, tetapi pada praktikum ini diinjeksikan 40 µL yang mana kelebihan sampel yang mengisi loop akan dikeluarkan menuju penampung. Tujuannya loud inject dengan jumlah tersebut adalah pada saat awal sampel akan memenuhi volume loop terlebih dahulu dan akhirnya akan segera masuk menuju kolom pemisahan dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun. Tahapan selanjutnya adalah dilakukan scanning pada panjang gelombang 200-400 nm sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum parasetamol adalah 245 nm. Panjang gelombang yang diperoleh sesuai dengan pustaka (Clarke, 2007). Larutan standar seri lainnya diukur pada panjang gelombang 200-400 nm. Pada saat penyuntikkan larutan ke dalam injektor, tidak boleh terdapat gelembung pada syringe. Apabila terdapat gas atau gelembung, maka gas atau gelembung tersebut akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mempengaruhi kromatogram yang dihasilkan. Setelah proses scanning diperoleh beberapa data, yaitu kromatogram (waktu retensi dan luas puncak). Namun pada praktikum ini larutan standar seri konsentrasi 12 µg/mL

dan 15 µg/mL tidak menunjukkan hasil

pemisahannya, hal ini mungkin disebabkan kesalahan pada pembuatan larutan seri sehingga parasetamol tidak tampak setelah proses scanning. Sehingga dari keenam larutan standar seri hanya empat yang menunjukkan hasil. Dari data AUC dan konsentrasi keempat larutan standar seri paracetamol, kemudian dibuat kurva kalibrasi standar parasetamol. Untuk mendapatkan kurva kalibrasi dengan nilai kolerasi 0,997 maka hanya digunakan tiga data dari keempat larutan standar seri tersebut. Tiga data tersebut adalah larutab standar seri dengan konsentrasi 3 µg/mL, 9 µg/mL

47

dan 18 µg/mL dengan nilai AUC masing-masing konsentrasi yaitu 537240, 1286703 dan 2168016 sehingga diperoleh persamaan regresi linier y = 107866,18x + 251.991,1 dengan r2= 0,997 dimana y = bx + a, y = AUC dan x = kadar sampel (µg/mL). Kurva kalibrasi larutan seri stok parasetamol yang diperoleh adalah:

Kurva Kalibrasi Larutan Standar Paracetamol Area Under Curve (AUC)

2500000 2000000 1500000 1000000 Linear (Area Under Curve (AUC))

500000 0 0

5

10

15

20

Konsentrasi Larutan Standar Parasetamol (µg/mL)

Selanjutnya

dilakukan

pembuatan

larutan

sampel

dengan

menimbang kaplet satu-persatu untuk mendapatkan bobot total dari ketiga kaplet tersebut. Setelah diperoleh bobot dari ketiga kaplet tersebut, dapat ditetaapkan jumlah sampel yang diambil dengan cara 100 mg sampel yang diambil dibagi dengan massa total tiga kaplet secara teoritis dikalikan bobot total 3 kaplet yang diperoleh dari penimbangan sehingga akan diperoleh jumlah sampel yang akan diambil untuk analisis dimana jumlah sampel itu akan mewakili 100 mg sampel yang akan digunakan pada proses analisis. Tujuan dilakukannya langkah ini adalah untuk meminimalisir kehilangan bobot akibat dari penggerusan kaplet yang akan dilakukan pada mortir. Sampel kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol. Konsentrasi larutan sampel yang diperoleh 10 mg/mL. Kemudian dilakukan pengenceran dari 10 mg/mL menjadi 100 µg/mL. Kemudian dibuat larutan sampel dengan konsentrasi 9 µg/mL. Setelah itu, sampel diinjeksikan ke dalam kolom

48

sejumlah 40 µL. Sebelum injeksi sampel, syringe harus dicuci terlebih dahulu karena kadar sampel yang dibuat kurang dari injeksi seri terakhir yaitu 18 µg/mL sehingga dikhawatirkan akan mempengaruhi luas AUC yang akan diperoleh. Kemudian ditunggu hingga muncul kromatogram pada komputer, setelah itu dilakukan pengolahan data dan diperoleh nilai AUC dan waktu retensi dari sampel tersebut. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali untuk menjamin presisi dari metode analisis yang dilakukan. Nilai AUC yang diperoleh dari sampel I, sampel II, dan sampel III secara berturut-turut adalah 1183131, 1213330, dan 1667554 dengan faktor similiaritas sebesar 0,937; 0,938; dan 0,940. Faktor similiaritas adalah derajat kedekatan sampel yang dianalisis dengan yang ada pada library HPLC dimana faktor similarity yang baik adalah 0,9-1 sehingga dapat dikatakan data ketiga sampel dapat dikatakan sudah baik jika dilihat dari similarity factor-nya. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap parameter kromatografi sebagai analisis kualitatif. Dari data diperoleh nilai parameter waktu retensi, tinggi puncak dan plat teoritis. Kemudian dilakukan perhitungan rata-rata terhadap nilai-nilai parameter di atas. Waktu retensi rata-rata parasetamol yang diperoleh sebesar 1,587 menit.

Berdasarkan

pustaka (Moffat et al., 2005), waktu retensi parasetamol dengan fase terbalik adalah 2 menit jadi berdasarkan data yang diperoleh waktu retensi parasetamol sudah mendekati pustaka, perbedaan waktu yang diperoleh dipengaruhi oleh situasi dan kondisi analisis yang dilakukan. Plat teoritis rata-rata yang diperoleh sebesar 115,34. Nilai plat teoritis yang besar menunjukkan pemisahan yang semakin baik. Dari data AUC yang diperoleh tersebut, kemudian dapat dilakukan analisis kuantitatif kadar sampel parasetamol dengan cara memasukkan data AUC pada persamaan regresi linier yang diperoleh dari larutan seri standar parasetamol yaitu y = 107866,18x + 251.991,1 dimana y = AUC dan x = kadar (µg/mL). Setelah dilakukan perhitungan kadar sampel I adalah 8,63 µg/mL, kadar sampel II adalah 8,91 µg/mL, dan kadar sampel III adalah 13,12 µg/mL. Selanjutnya dilakukan konversi kadar dalam mg sehingga

49

diperoleh kadar sampel I, II, dan III adalah 95,88 mg, 99 mg, dan 145,7 mg dengan rata-rata kadar parasetamol dalam sampel adalah 113,5 mg. Dari ketiga sampel tersebut kemudian dihitung nilai standar deviasi dari pengulangan yang dilakukan sehingga diperoleh standar deviasi sebesar 22,78 mg sehingga kadar rata-rata parasetamol dalam setiap sampel adalah 113,5 mg ± 22,78 mg. Dari kadar rata-rata parasetamol dalam sampel dikonversi kadar ratarata parasetamol dalam tiga kaplet sebenarnya sehingga diperoleh kadar parasetamol sebesar 1702,5 mg, dengan demikian kadar rata-rata parasetamol tiap kaplet adalah 567,5 mg dengan persen perolehan kembali yang diperoleh adalah 113,5% dari kadar parasetamol sebenarya yang tertera dalam etiket sebesar 500 mg. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Persen perolehan kembali yang diperoleh dapat dikatakan kurang baik, hal ini mungkin disebabkan oleh penimbangan sejumlah sampel yang setara dengan jumlah diperlukan tidak tepat sama, melainkan kurang atau lebih dari jumlah yang seharusnya ditimbang. Hal ini akan sangat mempengaruhi persen perolehan kembali yang akan diperoleh. Selain itu kurang bersihnya proses pencucian syringe setelah penginjeksian larutan seri dengan kadar yang lebih besar dari kadar sampel dapat menyebabkan besarnya nilai AUC sampel sehingga menyebabkan kadar yang diperoleh menjadi lebih besar dari kadar seharusnya. Selanjutnya dilakukan validasi terhadap metode analisis yang digunakan. Validasi metode analisis t dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007). Perolehan kembali menyatakan kecermatan. Kecermatan merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar sebenaranya. Pada penetapan kadar parasetamol dalam kaplet ini, nilai perolehan kembalinya sebesar 95,88%, 99% dan 145,7%. Rentang perolehan kembali untuk kadar sampel

50

lebih dari 10% adalah 98-102 % (Harmita, 2004). Pada penetapan kadar ini perolehan kembali sampel I dan III tidak memenuhi rentang tersebut sehingga metode yang digunakan tidak akurat. Selanjutnya dilakukan validasi metode analisis berupa presisi, linieritas, LOD dan LOQ. Selanjutnya validasi dengan presisi. Presisi diukur sebagai simpangan baku dan simpangan baku relatif (koefisien variasi atau KV) (Harmita, 2004). Semakin kecil nilai standar deviasi maka hasil yang diperoleh semakin baik, karena hasil yang diperoleh pada masing – masing pengukuran hampir sama. Nilai KV yang dipersyaratkan untuk kadar senyawa sekelumit adalah 5-15% dan untuk kadar senyawa aktif dengan jumlah banyak adalah 1-2% (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai KV yang diperoleh yaitu 20,07% sehingga tidak memenuhi rentang 5-15% dan dapat dikatakan metode analisis yang dilakukan belum mencapai presisi. Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang dapat diterima. Parameter yang diamati adalah nilai r dari persamaan linier dan simpangan baku residual (Sy). suatu data dikatakan linier apabila nilai r = 1 atau -1 (Harmita, 2004). Nilai r2 yang diperoleh adalah 0,997 yang hampir mendekati 1, sehingga data yang diperoleh dapat dikatakan linier. Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi

yang masih

memberikan respon

signifikan

dibandingkan dengan blangko. Batas kuantitasi (LOQ) merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Berdasarkan perhitungan nilai LOD yang diperoleh adalah 2,19 µg/mL yang berarti untuk dapat dideteksi, kadar minimal parasetamol yang harus ada pada sampel yang dianalisis adalah sebesar 2,19 µg/mL.

51

Sedangkan nilai LOQ yang diperoleh adalah 7,30 µg/mL yang artinya untuk dapat ditetapkan kadarnya, kadar parasetamol minimal yang harus ada pada sampel yang akan dianalisis adalah 7,30 µg/mL. Dilihat dari beberapa parameter validasi metode yang dilakukan, dapat dikatakan sebagian besar memberikan hasil yang baik, sehingga metode penetapan kadar parasetamol dalam kaplet dengan metode HPLC dengan detektor PDA dapat dikatakan valid.

IX. KESIMPULAN 9.1. Prinsip pemisahan menggunakan HPLC dengan detektor PDA adalah terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detektor PDA kemudian direkam dalam bentuk kromatogram 9.2. Kadar parasetamol tiap tablet yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 567,5 mg dengan persentase perolehan kembali sebesar 113,5%. 9.3. Berdasarkan beberapa parameter validasi metode yang dilakukan seperti akurasi, linieritas, dan LOD & LOQ dapat dikatakan metode penetapan kadar parasetamol dalam sediaan farmasi dengan metode HPLC adalah valid.

52